植物乳杆菌LL20缓解大鼠高尿酸血症的研究

1、前言

高尿酸血症（hyperuricemia，HUA）是一种因嘌呤代谢紊乱使人体血液中尿酸盐浓度超出正常水平的代谢类疾病。HUA定义为正常嘌呤饮食下，非同日两次空腹血尿酸水平男性>420 umol／L，女性>360umol／L。尿酸盐在血液中的饱和浓度为420 umoL／L(不分性别)，超过此值可引起尿酸盐结晶析出直接黏附、沉积于关节及周围软组织、肾小管和血管等部位，同时趋化中性粒细胞、巨噬细胞与晶体相互作用后释放致炎症因子(IL-1B、IL-6等)以及金属蛋白酶9等而引起关节炎、皮下痛风结石、肾脏结石或痛风性肾病、血管内膜等一系列临床表现。痛风是一种由尿酸钠晶体沉积在关节及非关节组织引起的代谢性疾病。近年来,我国髙尿酸血症呈明显上升和年轻化趋势，中国高尿酸血症的总体患病率为13.3%，患病人数约为1.7亿，痛风总体发病率为1.1%，患病人数约为1466万，特别是在经济发达的城市和沿海地区，HUA患病率达5％～23.5％，接近西方发达国家水平(孙泽锐等, 2021)。高尿酸血症已经赶超1.14亿糖尿病人群，紧追2亿高血压人群，2亿高血脂人群，成为“第四高”富贵病。HUA不仅是痛风发病的主要危险因素，还可引发高血糖、高血脂、高血压、肥胖、心血管疾病、糖尿病、慢性肾脏疾病及肾结石等多种并发症，这些共存疾病增加了HUA和痛风管理的复杂性，并可能导致患者早期死亡。有效防治高尿酸血症及痛风已引起人们的高度重视和关注，关于到我国千家万户百姓的身心健康和高质量生活。

已有研究表明：尿酸是嘌呤在肝脏中代谢的最终产物。人体尿酸来源于两个方面：(1)内源性尿酸（约占80%）：人体细胞内核蛋白分解代谢产生的核酸和其它嘌呤类化合物经一些酶的作用而生成；(2)外源性尿酸（约占20%）：食物中所含的嘌呤类化合物（核酸及核蛋白）被消化吸收后经一些酶的作用生成。内源形成的尿酸有三分之二通过肾脏排出，剩余的三分之一则由肠道排出，其中部分排出的尿酸会通过转运蛋白被肠道重吸收，因此，降低尿酸在肝脏中的形成和在肾脏中的重吸收及增加尿酸在肠道内的分解和排出是一种降低血尿酸的可行途径。但防治HUA传统方法存在效果差、药物依赖性、副作用大及饮食控制困难等问题，因此，开发安全、有效、且无副作用的具有预防及缓解高尿酸症和痛风的方法刻不容缓。

人类肠道微生物群由至少1000种不同类型的细菌、古细菌、真核微生物和病毒组成，基因总数超过300万个，具有强大的代谢能力，在营养吸收、能量获取、炎症调节和免疫应答等方面发挥着重要作用。大量研究表明，特定益生菌能够通过抗氧化、增强肠道屏障功能、调节免疫反应和改善肠道菌群组成等途径，在不同程度上缓解高尿酸血症及相关炎症反应。进一步研究发现，高尿酸血症患者的肠道微生物群与健康人群存在显著差异，肠道微生物在高尿酸血症和痛风等代谢性疾病的发生和发展中具有关键作用。微生物干预作为一种经济有效且副作用低的治疗手段，已逐渐受到认可。然而，传统益生菌在降低血尿酸水平和改善相关炎症方面效果有限。为此，本研究旨在探究植物乳酸杆菌 LL20（分离自兰州浆水）对大鼠高尿酸血症的效果及机理，为益生菌应用于人类高尿酸血症及通风的防治提供基础。

2、材料与方法

2.1 菌种及实验对象

菌种：植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）LL20，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20232427 LL20。

实验对象：大鼠，型号为Wistar，雄性，平均体重200g（±20g），8周龄，购自中国上海斯莱克实验动物有限公司。

2.2 植物乳杆菌LL20培养与菌液制备

取保存的植物乳杆菌LL20菌液，按5%（v/v）的接种量接种于灭菌MRS液体培养基中，于涡旋振荡器中混匀，静置于厌氧培养箱中，在37℃条件下培养过夜，于4℃，5000 r/min条件下离心2 min，弃上清，将菌体沉淀用预冷的无菌PBS洗涤2次后重悬，制备得到新鲜菌液。

2.3 动物试验

选取32只的雄性8周龄Wistar大鼠，饲养于浙江大学第一附属医院动物实验中心，所有动物实验均按照浙江大学动物护理和使用委员会的指南并获得其批准进行。环境温度20℃±2℃，相对湿度50%～60%，照明12/12 h明暗交替，自由采食和饮水。预饲一周后，随机分为四组（n=8/组）：对照组（CON），HUA造模组（DSS），阳性药别嘌醇（AP）预处理组，以及植物乳杆菌LL20处理组（LL20）。实验设计示意图如图1所示。其中，CON组小鼠定时每日灌胃两次0.1 mL/10 g 体重（Body weight，B.W.）的生理盐水。其余小鼠每日上午灌胃HUA造模液一次，在第7、14和21天抽取大鼠尾静脉血检测包含尿酸（UA）在内的指标检验模型建立是否成功。其中，HUA组大鼠下午灌胃一次0.1 mL/10 g B.W. 生理盐水，AP组大鼠灌胃30 mg/kg B.W.别嘌醇溶液，LL20组大鼠灌胃0.1 mL/10 g B.W. 新鲜植物乳杆菌LL20（活菌数为1×108 CFU/mL）菌液，所有试剂现用现配。试验期持续21d。第22d，安乐死所有大鼠，采集大鼠血清及相应组织及内容物以供后续分析检测。

图1 高尿酸血症大鼠实验设计示意图

注：CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

2.4 生理生化检测

采用试剂盒测定血清中SOD、MDA和GPX水平。蛋白质浓度使用BCA蛋白质测定试剂盒校准。使用自动生化分析仪分析血清中丙氨酸氨基转移酶（Alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate aminotransferase，AST）、总胆红素（Total bilirubin，TBIL）、直接胆红素（Direct bilirubin，DBIL）、间接胆红素（Indirect bilirubin，IBIL）、总蛋白（Total protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALB）、球蛋白（Globulin，GLO）水平、碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）、γ-谷氨酰转移酶（Gamma-glutamyl transferase，γ-GT）、总胆汁酸（Total bile acids，TBA）、葡萄糖（Glucose，GLU）、果糖（Fructose，FRU）、甘油三酯（Triglycerides，TG）、总胆固醇（Total cholesterol，TCHO）、肌酸激酶（Creatine kinase，CK）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）、尿酸（Uric acid，UA）、肌酐（Creatinine，CREA）、尿素（Urea，UREA）、血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）、淀粉酶（Amylase，AMS）、脂蛋白脂肪酶（Lipoprotein lipase，LPL）和二氧化碳（Carbon dioxide，CO₂）。此外，IBIL通过TBIL和DBIL的差值计算得出，ALB通过TP和GLO的差值计算得出。所有步骤均依照制造商说明书进行。

2.5 组织病理学检测

大鼠肾脏、肝脏组织片段，4%多聚甲醛固定，使用自动旋转切片机将其切割成4 mm切片，并包埋在石蜡中。依据制造商说明书，组织切片（5 µm）进行H&E染色，在Olympus光学显微镜下对组织切片进行成像和分析。

2.6 代谢组学分析

采用液相色谱-气相色谱（LC-GS）技术检测大鼠血清代谢物成分。样品处理后上机检测，针对所得离子产生的质谱峰总离子流色谱图，通过控制软件进行一级、二级质谱数据采集，原始数据经Proteo Wizard软件转成mz XML格式后，使用自主编写的R程序包（内核为XCMS）进行峰识别、峰提取、峰对齐和积分等处理，然后与二级质谱数据库匹配进行物质注释，算法打分的Cutoff值设为0.3。根据代谢物的峰面积，采用差异倍数法（Fold Change,FC）筛选差异代谢物质。

2.7 数据分析和统计检验

所有实验至少重复三次，结果以均值±标准误表示，P<0.05具有统计学意义。使用SPSS 22.0对数据进行统计分析，采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）的Tukey检验，以及双尾t检验，对数据进行显著性较分析。使用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行分析处理并作图。使用SPSS和R进行结肠转录组和微生物群落的Spearman相关分析。

3、结果与讨论

3.1 植物乳杆菌LL20缓解HUA大鼠尿酸升高与肾功能损伤

在试验期间，与对照组相比，HUA组大鼠尿酸（UA）水平上显著升高，证明高尿酸血症造模成功。与HUA组相比，阳性药别嘌醇治疗组（AP）和植物乳杆菌LL20治疗组（LL20）明显降低了大鼠血清UA的水平，表明了两者具有降低血尿酸的能力，且LL20降低血尿酸的能力与阳性药效果相当。同时，HUA造模也使肌酐（CREA）和尿素（UREA）的水平在3周内均升高。肌酐和尿素反映了肾脏的滤过和排泄功能，指标升高提示肾功能受损和尿酸排泄能力的下降。这其中，肌酐是肌肉代谢的产物，主要来源于肌酸和磷酸肌酸在肌肉组织中的分解，由肾小球排出体外，它的升高表明肾小球的滤过率下降，肾功能受损；而尿素则是蛋白质代谢的终产物，主要在肝脏中由氨合成，由肾小球滤过排出体外，部分尿素在肾小管中可被重吸收，受到饮食摄入、肝脏功能和肾脏功能的同时影响。AP和LL20的处理都持续下调了两者的水平，且LL20对血清尿素的下调幅度相较于AP更大，尤其是在实验末期（21d）。以上结果表明，阳性药别嘌醇（AP）和植物乳杆菌LL20处理均缓解了HUA导致的尿酸升高，改善了肾功能损伤，其中LL20在降低血清尿素方面表现出更强的调节作用，提示其在缓解高尿酸血症时可能通过肾脏功能调节及其他代谢通路共同发挥作用。

图2 植物乳杆菌LL20在不同时间对高尿酸血症大鼠肾功能指标的影响

注：UA，尿酸；CREA，肌酐；UREA，尿素。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

3.2 植物乳杆菌LL20缓解HUA大鼠肝功能损伤

如图3所示，HUA组大鼠明显升高了整个实验期间的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，而AP和LL20缓解了这种水平上升，表明了LL20对肝功能的保护作用与阳性药AP相当，凸显其作为有效治疗手段的潜力。

图3 植物乳杆菌LL20在不同时间对高尿酸血症大鼠肝功能指标的影响

注：ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，天冬氨酸氨基转移酶。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

3.3 植物乳杆菌LL20对HUA大鼠其他血清生化指标的影响

图4 为实验结束时采集血清进行生化指标检测。与CON组相比，HUA中多个指标发生显著变化。其中，HUA组的尿酸（UA）、肌酐（CREA）、尿素（UREA）和血尿素氮（BUN）显著升高，提示肾功能受损，尿酸代谢紊乱。淀粉酶（AMS）水平升高，反映胰腺功能异常，而脂蛋白脂肪酶（LPL）降低，表明脂肪代谢能力受损。二氧化碳（CO₂）水平下降，提示酸碱平衡紊乱。抗氧化指标中，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）活性降低，丙二醛（MDA）水平升高，表明体内氧化应激增强。丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）显著升高，表明肝细胞受损；AST/ALT比值的上升进一步暗示肝脏功能异常。总蛋白（TP）和白蛋白（ALB）水平降低，说明HUA组大鼠蛋白质合成能力下降，而球蛋白（GLO）升高，导致ALB/GLO比值下降，提示炎症反应增加。碱性磷酸酶（ALP）和γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）升高，反映胆道或肝功能受损。在胆红素方面，HUA组的总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）和间接胆红素（IBIL）均升高，提示肝脏排泄功能受损。总胆汁酸（TBA）也增加，进一步说明胆汁排泄功能障碍。此外，葡萄糖（GLU）和果糖（FRU）水平升高，表明糖代谢紊乱。脂质代谢指标中，甘油三酯（TG）和总胆固醇（TCHO）升高，表明脂质积累增加。肌酸激酶（CK）和乳酸脱氢酶（LDH）水平升高，反映肌肉和细胞损伤加重。

与HUA组相比，AP阳性药物组和植物乳杆菌LL20组在多项指标上表现出显著改善。两组均降低了ALT和AST，表明肝细胞损伤得到缓解，同时TP和ALB水平回升，ALB/GLO比值提高，炎症反应减轻。ALP和γ-GT水平下降，提示胆道和肝功能改善。胆红素相关指标（TBIL、DBIL、IBIL）以及TBA也显著降低，反映肝脏排泄功能恢复。在糖脂代谢方面，AP组和LP组均降低了GLU、FRU、TG和TCHO水平，表明糖脂代谢紊乱得到改善。两组的CK和LDH水平降低，反映细胞和肌肉损伤缓解。UA、CREA和UREA水平显著下降，提示肾功能改善，尿酸代谢趋于正常。AMS水平降低，反映胰腺功能恢复；LPL水平升高，提示脂肪代谢功能改善。抗氧化指标方面，SOD和GPX活性回升，MDA水平降低，表明氧化应激得到缓解。

图4 植物乳杆菌LL20对高尿酸血症大鼠其他血清生化指标的影响

注：ALT/AST，丙氨酸氨基转移酶/天冬氨酸氨基转移酶比值；A/G，白蛋白/球蛋白比值；TP，总蛋白；ALB，白蛋白；GLO，球蛋白；ALP，碱性磷酸酶；γ-GT，γ-谷氨酰转移酶；T-BIL，总胆红素；D-BIL，直接胆红素；I-BIL，间接胆红素；TBA，总胆汁酸；GLU，葡萄糖；FRU，果糖；TG，甘油三酯；TCHO，总胆固醇；CK，肌酸激酶；LDH，乳酸脱氢酶；AMS，淀粉酶；LIP，脂肪酶；CO₂，二氧化碳；SOD，超氧化物歧化酶；MDA，丙二醛；GPX，谷胱甘肽过氧化物酶。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

整体来看，AP在降低UA和CREA水平方面效果更显著，而LP在改善UREA、ALT、AST以及抗氧化指标方面表现出较好效果，表明植物乳杆菌LP220主要通过缓解肝肾功能损伤、改善尿酸代谢及氧化应激等机理改善高尿酸血症。

3.4 植物乳杆菌LL20对HUA大鼠肾脏组织病理学的改善作用

如图5所示，在CON组中，肾小球和肾小管的结构清晰完整，管腔通畅，间质未见明显炎症细胞浸润或纤维化；在HUA组中，肾小管出现扩张，间质可能有水肿现象，并伴随炎症细胞浸润，肾小球结构可能出现轻微硬化或肿胀；AP组的肾小管扩张和间质疏松现象较HUA组有所改善，肾小球形态相对保留但仍存在轻微病变；LL20组的肾小管和肾小球结构接近CON组，间质水肿和炎症细胞浸润情况有所缓解，整体组织结构较为规整。这些结果提示植物乳杆菌LL20LL20在保护肾脏损伤方面与阳性药别嘌醇（AP）效果相当。

图5 植物乳杆菌LL20对高尿酸血症大鼠肾脏H&E的影响

注：大鼠肾脏H&E代表性图片。原始图像放大倍数为40倍（上）和100倍（下）。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

3.5 植物乳杆菌LL20对HUA大鼠肝脏组织病理学的改善作用

如图6所示，在CON组中，肝细胞结构规则，细胞排列紧密，肝细胞核清晰可见，肝索和窦状隙结构清楚，未见炎症细胞浸润或坏死；在HUA组中，肝细胞排列紊乱，细胞肿胀，部分肝细胞可能出现坏死，窦状隙扩张，炎症细胞浸润明显，肝组织结构紊乱；AP组的肝细胞肿胀和坏死较HUA组有所缓解，炎症细胞浸润减少，窦状隙结构部分恢复，但肝细胞排列略显紊乱；LL20组的肝细胞结构接近CON组，细胞肿胀和坏死显著减少，炎症细胞浸润明显缓解，窦状隙结构恢复正常，肝细胞排列整齐。可以说，HUA组的肝脏出现明显的炎症、肿胀和坏死，而AP组和LL20组的肝脏病变有所改善，其中LL20组的组织结构和细胞形态接近对照组，显示出较好的保护作用。

图6 植物乳杆菌LL20对高尿酸血症大鼠肝脏H&E的影响

注：大鼠肝脏H&E代表性图片。原始图像放大倍数为40倍（上）和100倍（下）。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

3.6 植物乳杆菌LL20对HUA大鼠血清代谢物的影响

通过代谢组学分析进一步探讨植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum LL20 对高尿酸血症（HUA）大鼠的调节作用。主成分分析（PCA）结果显示，CON组、HUA组、AP组和LL20组在代谢特征上分布明显分开，表明高尿酸血症导致的代谢异常显著，而LL20和AP处理后代谢特征向CON组靠拢（图7A）。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）进一步验证了组间的代谢物特征差异，HUA组与CON组显著分离，而LL20和AP组接近CON组，提示LL20和阳性药物均可改善HUA引起的代谢紊乱（图7B）。PLS-DA Splot 显示，鸟氨酸、尿苷和氧化甘油三酯等代谢物对组间差异贡献较大（图7C）。HUA组与CON组的代谢物比较显示，HUA组中尿酸、棕榈酸和胆酸等代谢物显著上调，提示嘌呤代谢和脂质代谢紊乱（图7D）。AP组与CON组的代谢物差异分析表明，阳性药物处理显著改善了赖氨酸、葡萄糖酸等代谢物的水平（图7E）。LL20组与CON组的比较显示，LL20干预后胆烷二酸、天冬氨酸等代谢物水平接近CON组，表明LL20在调节氨基酸和脂质代谢方面具有潜在作用（图7F）。AP组与HUA组的代谢物差异分析显示，阳性药物显著下调了乳糖酸和木糖等异常代谢物（图7G）。LL20组与HUA组的代谢物比较显示，LL20处理可显著改善N-乙酰神经氨酸和苯丙氨酸等代谢物，表明LL20对高尿酸血症引起的代谢紊乱具有缓解作用（图7H）。LL20组与AP组的比较发现，两者在调节胆烷二酸、乙酰丙酸等代谢物方面存在差异，提示LL20和阳性药物在代谢调节机制上有所不同（图7I）。

综上所述，植物乳杆菌 LL20 可显著改善高尿酸血症大鼠的血清代谢特征，其效果与阳性药物相当，但在某些代谢通路上具有独特的调节作用。

图7 植物乳杆菌LL20对高尿酸血症大鼠血清代谢组的影响

注：A，主成分分析（PCA）显示各组间的代谢物分布；B，偏最小二乘判别分析（PLS-DA）显示各组间代谢特征的区分；C，PLS-DA Splot 显示代谢物对组间差异的贡献；D，HUA组与CON组的代谢物差异分析；E，AP组与CON组的代谢物差异分析；F，LL20组与CON组的代谢物差异分析；G，AP组与HUA组的代谢物差异分析；H，LL20组与HUA组的代谢物差异分析；I，LL20组与AP组的代谢物差异分析。CON，对照组；HUA，高尿酸血症造模组；AP，别嘌醇阳性药处理组；LL20，植物乳杆菌LL20处理组。

4、总结

本研究通过对高尿酸血症（HUA）大鼠的生化指标和代谢组学分析，系统评估了植物乳杆菌 Lactobacillus plantarum LL20 对高尿酸血症及其相关肝肾功能损伤的缓解作用。结果显示，HUA组大鼠表现出显著的肝肾功能受损，包括ALT、AST、UA、CREA、UREA等指标升高，同时伴有脂质代谢紊乱和氧化应激增加。植物乳植杆菌LL20干预后，这些异常指标显著改善，肝肾功能逐步恢复，炎症和氧化应激水平降低，效果与阳性药物相当。代谢组学分析进一步揭示了HUA组大鼠在嘌呤、氨基酸、脂质和糖代谢等多个通路中存在显著紊乱。LL20能够显著调节多种异常代谢物，使其向正常水平恢复，部分代谢通路的调节效果与阳性药物相似，但在胆烷二酸、乙酰丙酸等代谢物上表现出独特的调节作用。以上结果表明，植物乳杆菌LL20具有缓解高尿酸血症及相关肝肾损伤的潜力，其保护机制可能通过改善嘌呤代谢、调节肝肾功能和氧化应激来实现，为高尿酸血症的防治提供了新的候选益生菌。

（文、图/浙江大学  李响  王斐  张乔  李卫芬）